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2024年7月山东大学丁兆军教授团队在Advanced Science（IF=14.3）杂志上发表题为“VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis”文章。研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现VIK介导的生长素信号转导分别通过增强LBD18的蛋白质稳定性和诱导ERF13的降解来调节侧根发育。拜谱生物为该研究提供了磷过酸遮盖组学、LC-MS/MS磷过酸位点浅析技术服务。
英文翻译主题词：VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis（Advanced Science，IF=14.3，2024.07）
繁体中文宝贝标题：VIK介导的生长素信号调节拟南芥侧根发育
雇主工作单位：山东大学
深入分析的原材料：拟南芥侧根
拜谱可以提供科技：磷碱化表达组学、LC-MS/MS磷碱化位点研究分析
深入分析基本思路：
PART 01 研究探讨但是
01、生長素有利于VIK的磷酸性反应下列关于转录
为了鉴定生长素触发的潜在磷酸化调控因子，作者对10日龄拟南芥幼苗根用10 µM 萘乙酸（NAA）处理15分钟和8小时后进行磷碱化核蛋白混合物析，结果发现VIK可能通过磷酸化修饰在介导生长素信号传递中发挥关键作用（图1A）。
图1 衍生素带动VIK的磷硝化作用以及转录
为了验证上述结果，作者在大肠杆菌中表达了带有6个组氨酸标签的重组VIK蛋白（His-VIK），并在细胞自由蛋白系统中进行了磷过酸检测。发现His-VIK随着时间的推移磷酸化水平略有增加。在野生型拟南芥幼苗的根组织裂解液中，NAA处理15分钟和30分钟后，His-VIK的磷酸化水平显著增加，表明生长素能显著促进VIK的磷酸化（图1B）。
通过发酵粉双混种深入分析（Y2H）和烟草叶片中的荧光素酶专一性成相实验英文（LCI）证实了VIK与TMK1之间存在直接相互作用，并且身体外磷过酸实验表明TMK1可以磷酸化VIK。通过生成ProVIK:VIK-GFP转基因系进行的蛋白降解实验显示生长素可能不影响VIK蛋白的稳定性（图1C）。实时时间降钙素原检测PCR分析发现，生长素处理能时间依赖性地诱导VIK转录水平的增加（图1D），且这种诱导主要通过ARF7/19依赖性方式实现，在arf7/19突变体中VIK表达的诱导明显减弱，而在lbd16/18/33突变体中VIK表达仍能被生长素显著诱导。
02、VIK 介导的叶绿素的信号提高认识调空 LR 健康发育
借助进行分析两只VIK T-DNA进到这一领域变动的体（vik-2和vik-3），意味着与野生植物型相比较，变动的体的LR体积高密度、LR原基（LRP）和已骨骼發育成熟的LR有明显降低，尤其是是vik-2（图2）。相同，过理解VIK的转染色体植物抒发出LR体积高密度增强。不仅如此，在vik-2变动的体环境下理解VIK的转染色体植物还原了LR骨骼發育成熟常见问题。产生素除理实验所意味着，vik-2变动的体对产生素帮助的LR骨骼發育成熟不良反应降低，意味着VIK在产生素改善LR骨骼發育成熟中挥发重要的角色。 
图2 VIK介导的种植素的信号环路单向调整LR的阴茎发育
03、VIK 与ERF13 实施物理上的交互设计
研究发现VIK在生长素诱导的侧根（LR）发育中扮演关键角色，因此推测ERF13可能是VIK的潜在底物。通过Y2H、LCI、双大分子荧光互补原理 （BiFC）和抗体共析出检测（CO-IP），证实了VIK与ERF13之间存在直接的相互作用（图3）。这些结果表明VIK与ERF13在物理上相互作用，支持了ERF13可能是VIK作用底物的假设。
图3 VIK与ERF13能够 用处
04、VIK以正反面馈的的方法调节管控ERF13磷过酸
通过磷过酸蛋白质组学研究分析，发现NAA处理可快速诱导ERF13磷酸化。体外实验表明，VIK具有自磷酸化活性，并可直接磷酸化ERF13的Ser168和Ser172位点（图4）。点突变性会发现显著降低了ERF13的磷酸化水平。此外，ERF13可增强VIK的自磷酸化，尤其是ERF13的磷酸模拟突变体。进一步实验表明，VIK可通过形成同源二聚体进行自磷酸化，但ERF13突变体不影响VIK二聚体的形成。总体而言，VIK通过反馈机制调控ERF13的磷酸化。
图4 VIK以双面馈手段磷碱化ERF13的Ser168和Ser172位点
05、VIK介导的磷酸性反应驱动ERF13吸附
研究发现，VIK介导的磷酸化作用影响ERF13蛋白的稳定性，进而调控侧根发育。实验显示，ERF13蛋白在早期侧根原基中表达，随后在发育过程中消失，而VIK蛋白在所有侧根中持续表达（图5）。通过离体工作和身上工作，发现VIK能够促进ERF13的降解。进一步通过磷酸模拟系统和磷酸解离突变率体的实验，证实了ERF13在Ser168和Ser172位点的磷酸化促进了其降解。此外，VIK与MPK14可能协同作用促进ERF13降解，但两者之间没有直接的相互作用。最后亚细胞核固定定量分析表明，ERF132D和ERF132A均位于细胞核，且与WT无明显差异。qRT-PCR结果显示，vik-2突变体中ERF13 mRNA水平未显著变化，但其下游基因KCS8和KCS16显著降低，进一步证明VIK在蛋白水平上调控ERF13。总之，VIK介导的磷酸化通过负调控ERF13的稳定性，加速生长素诱导的ERF13降解。
图5 VIK 介导的磷碱化加速器了ERF13挥发
06、VIK 介导的 ERF13 磷碱化改善 LR 的发现
分析进第一步浅议了VIK改善的ERF13光挥发在侧根（LR）健康中的反应。在特别的不相同转表观遗传植被系的LR表型，看见过形容出来方法ERF13抑做成用功用了LR的有，在vik基因变异体中这个抑做成用功用反应加强，而在过形容出来方法YFP-VIK的大环境下这个抑做成用功用反应降低（图6）。除此以外，特别ERF13的的不相同磷酸性反应虚拟和磷酸解离基因变异体的过形容出来方法植被系，看见ERF132A-Myc（磷酸解离）的植被系LR有比较少，而ERF132D-Myc（磷酸性反应虚拟）的植被系LR有略多。这没想到呈现，VIK介导的ERF13磷酸性反应和光挥发可以淡化了LR的有。 
图6 VIK介导的ERF13磷过酸推动LR的发现
07、VIK在侧根发育状况中磷硝化作用并安稳LBD18蛋清
实现研究分析2个VIK T-DNA放进去突然变化体（vik-2和vik-3），发现与纯天然型比起，突然变化体的侧根（LR）体积规格、LR原基（LRP）和已成长的LR取得极大减少，通常是vik-2（图7）。相左，过描述VIK的转染色体食品遗传植物成绩出LR体积规格扩大。另外，在vik-2突然变化体题材下描述VIK的转染色体食品遗传植物还原了LR成长弊病。种植素治疗实验操作表达，vik-2突然变化体对种植素引导的LR成长表现降低，表达VIK在种植素政策调控LR成长中表现要点用处。 
图7 VIK 在LR演变成整个过程中简单磷碱化和不稳定性LBD18球蛋白
PART 02 优秀文章工作小结
生长素作为最重要的植物激素之一，在调控植物生长和发育过程中起着关键作用。这项研究通过磷硝化作用血清质组学分折筛选到快速响应生长素的蛋白激酶VIK，并证实VIK通过调控LBD18和ERF13来调控侧根的形成。一方面，生长素以ARF7/19依赖的方式诱导VIK的转录；另一方面，它通过TMK1激活VIK的激酶活性，激活的VIK可以磷酸化LBD18和ERF13。磷酸化的LBD18变得更加稳定，调节侧根的启动。然而，磷酸化的ERF13经历降解，缓解了其对侧根出现的抑制，从而促进侧根的形成（图8）。VIK的发现不仅丰富了我们对生长素信号传递机制的理解，而且为农业生产中通过调控生长素信号来提高作物产量和抗逆性提供了潜在的策略。
图8 VIK介导的种植素走势设定侧根演变成
PART 03 拜谱个人心得体会
研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现 VIK 介导的生长素信号转导分别通过增强 LBD18 的蛋白质稳定性和诱导 ERF13 的降解来调节 LR 发育。拜谱生物作为一家国内领先的多组学服务公司，可提供完善成熟的蛋清质组学、装饰蛋清质组学、分泌组学、转录组学等多组学产品技术服务体系。拜谱特色磷酸化修饰产品—超多深度的DIA·磷硝化作用体现组，采用创新生物富集新技术+Astral DIA，超高深度赋能低丰度磷酸化蛋白/位点发掘，单针最高可实现绿色子样本量10w+、植被子样本量5w+磷酸化修饰位点检出，可广泛应用于植物、动物研究，绘制物种磷酸化修饰图谱，助力高分文章发表。此外，磷酸化修饰组学可与蛋白组学、代谢组学等多组学联合，整合多组学数据进行深入挖掘分析，全面解析机制机理等。欢迎咨询！
分类资料：
Shang E, Wei K, Lv B, Zhang X, Lin X, Ding Z, Leng J, Tian H, Ding Z. VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis. Adv Sci (Weinh). 2024 Jul 3:e2402442. doi: 10.1002/advs.202402442. Epub ahead of print. PMID: 38958531.
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